文獻背景

基本信息

摘要

研究內容及結果

1. M-FDH的表征

2. 癌細胞體外細胞攝取及誘導ICD的療效

通過流式細胞儀檢測從4T1乳腺癌腫瘤中分離出的4T1癌細胞和原發性CAFs中M-FDH的細胞攝取與FDH的比較。與FDH相比，M-FDH優先被4T1癌細胞和CAFs吸收(圖2A)，這主要是由于M-FDH系統具有模擬癌細胞微泡的特性。細胞毒性分析表明，游離HF、FDH和M-FDH治療及其聯合放療對4T1癌細胞的活性具有顯著的濃度依賴性抑制作用，但游離DiD對4T1癌細胞的細胞毒性可忽略不計(圖2B)。克隆分析表明，游離DiD處理對菌落形成影響不大，HF、FDH和M-FDH處理對菌落形成有一定的抑制作用。而輻射組菌落形成明顯減少。M-FDH + X射線治療顯著的細胞毒性可能是由于輻射治療的協同作用，輻射介導的ROS和HF的產生。輻射后，M-FDH在輻射作用下具有有效的ROS生成活性，有利于誘導癌細胞的ICD(圖2C-D)。通過測量CRT暴露、HMGB1釋放和ATP分泌等DAMPs信號的表達來檢測4T1癌細胞中ICD的發生率。結果表明，M-FDH + X射線治療可誘導腫瘤細胞產生相當大的ICD，具有誘導抗腫瘤免疫應答的潛力(圖2E-H)。

3. M-FDH的腫瘤聚集和瘤內分布

4T1乳腺癌模型體內成像檢測M-FDH和FDH的腫瘤積累。如圖3A所示，證實了M-FDH優先在腫瘤部位積累。腫瘤血管有效的瘤內滲透和外滲可促進腫瘤內各種細胞成分的接觸。M-FDH較FDH具有更強的穿透腫瘤的能力(圖3C-F)，主要是由于M-FDH具有微囊激發的納米結構。如圖1所示，M-FDH可以保留癌細胞細胞膜的仿生特性，以生物激發的方式促進其瘤內運輸，并促進其在腫瘤組織中被各種細胞組分進一步內化。

隨后，測量了4T1腫瘤中M-FDH對癌細胞和CAFs的可達性(圖4)。為了評估其對癌細胞的可達性，使用4T1-gfp乳腺癌細胞建立了腫瘤模型。由圖4A-B可知，M-FDH比對應的FDH具有更好的癌細胞可及性。同時，在4T1腫瘤中，M-FDH與CAFs的共定位證明了M-FDH對CAFs的有效性，被標記為α-SMA+/CD31-細胞(圖4C)。在腫瘤組織中，癌細胞通常嵌在多功能基質細胞(如CAFs、TAMs和ECs)中，這些基質細胞分布豐富且不均一。M-FDH不僅能接觸到癌細胞，還能大量被其他基質細胞內化，為殺死癌細胞、改造腫瘤基質和調節抗腫瘤免疫提供了次基質條件。

4. 對腫瘤氧化、ROS產生和DNA損傷的影響

考慮到M-FDH在腫瘤內的有效分布及其氧傳遞潛能，我們通過光聲成像測量氧合血紅蛋白信號，評估了它們在4T1腫瘤模型中改善腫瘤氧合的能力。圖5A-C證實了M-FDH對緩解腫瘤缺氧的作用。通過與FDH和M-FDH配方的比較，M-FDH在改善腫瘤氧合方面的增強效果可能是由于M-FDH中多氟碳納米系統和癌細胞微泡的協同作用，表現出突出的氧傳遞和瘤內分布能力。鑒于腫瘤氧化作用的顯著增強，測量了M-FDH暴露于6 Gy X射線輻射時產生ROS的活性。結果表明，M-FDH處理在X射線照射下產生ROS和造成DNA損傷方面效果明顯(圖5D-E)。

5. M-FDH + X射線照射對腫瘤間質重構的影響

腫瘤間質由CAFs等多種細胞成分和ECM的多種蛋白組分組成。考慮到M-FDH在腫瘤中對CAFs具有相當大的可及性，評估了CAFs的頻率和ECM幾種典型成分的表達，以評估M-FDH + X射線輻射對腫瘤基質重構的影響。經典的CAFs被鑒定為α-SMA^-、FAP^-和FSP⁺亞型。在PBS、FDH、M-FDH處理和M-FDH + X線處理的腫瘤中，CAFs的典型標記如α-SMA、FAP和FSP的熒光信號廣泛檢測到，但在每個處理的輻射腫瘤中明顯減少(圖6A-B)。此外，組織學檢查顯示M-FDH + X線組腫瘤組織松散，明顯核固縮和出血(圖6C)。因此，這些數據驗證了M-FDH介導的放療在消除腫瘤中的CAFs方面的*療效。

進一步測量了M-FDH + X射線治療對不同治療腫瘤中I型膠原、纖維連接蛋白、HA和粘連蛋白C等典型ECM成分的影響(圖7)。免疫熒光分析表明，PBS組檢測到這些典型成分的熒光信號明顯，但FDH、M-FDH和所有輻照處理均明顯降低(圖7A)。而且在M-FDH + X線處理組中，I型膠原、HA和膠原蛋白C的表達較PBS對照、未輻照M-FDH處理組、和FDH + X線處理組顯著降低了(圖7B)。結果表明，M-FDH介導的輻射能有效地清除ECM的主要成分。從圖6和圖7的數據可以推斷，M-FDH + X處理導致CAF頻率顯著降低，I型膠原、纖維連接蛋白、HA和粘連蛋白C等ECM主要成分顯著變性，導致腫瘤間質屏障大規模破壞。

6. M-FDH + X射線輻射增強抗腫瘤免疫的作用

鑒于M-FDH + X射線治療可有效產生ROS，通過檢測腫瘤中CRT的表達和HMGB1的釋放以及附近淋巴結DCs的成熟來檢測ICD誘導活性。M-FDH + X射線處理組的CRT熒光信號較強，熒光強度遠高于其他組(圖8A)。結果表明，M-FDH + X線治療可有效誘導腫瘤ICD的發生，顯示出極大的誘導抗腫瘤免疫應答的潛力(圖8B-C、圖8h + X線治療組)。

由于CD8⁺ T細胞是發揮癌癥殺傷作用的主要效應細胞之一，測量了M-FDH + X射線治療對4T1腫瘤中細胞毒性CD3⁺CD8⁺ T細胞浸潤的影響。M-FDH + X射線處理對CD3⁺CD8⁺ T細胞頻率的增強效果好(圖8D)。M-FDH + X線組CD8⁺ T細胞占CD3⁺ T細胞的比例比PBS組、M-FDH組和FDH + X線組增強2.83、1.73和1.32倍(**p < 0.01)。在M-FDH + X射線處理組中，表達IFN-γ的CD3⁺CD8⁺ T細胞比例較PBS對照和未輻射M-FDH組明顯提高4.41和1.88倍(圖8E)，表達顆粒酶B的CD3⁺CD8⁺ T細胞數量分別提高3.01和1.60倍(圖8F)。結果表明，M-FDH + X射線治療明顯改善了CD3⁺CD8⁺ T細胞的浸潤及其腫瘤殺傷亞型。

接下來，評估了每種治療方法對消除腫瘤中抑制性免疫細胞的影響。TAMs是腫瘤中很豐富的抑制性免疫細胞之一，主要表現為M2表型，流式細胞術分析為F4/80⁺CD206⁺CD80^?細胞。M-FDH + X線治療組M2巨噬細胞比例與M-FDH + X射線處理M1巨噬細胞的數量比值為2.85，遠高于其他處理(圖8G)。然后，M-FDH + X射線處理后，腫瘤中MDSCs的頻率明顯下降至3.99±0.43%，與PBS對照相比減少了60.54%(圖8H)。同時，M-FDH + X射線治療后，腫瘤中Treg的數量顯著減少至21.33±1.86%，僅為PBS組的46.58%，遠低于其他治療組(圖8I)。此外，與PBS對照相比，M-FDH + X射線處理的腫瘤中TGF-β的表達明顯降低了73.26%，且遠低于其他組(圖8J)。結果表明，M-FDH + X線能明顯緩解腫瘤的免疫抑制，顯示出極大的抗腫瘤治療潛力。

7. M-FDH + X射線治療的體內療效

受到M-FDH + X射線治療在破壞腫瘤間質和增強抗腫瘤免疫方面的普遍效果的啟發，我們在4T1乳腺癌模型中評估了它們的治療效果(圖9A)。在腫瘤生長譜中，M-FDH + X線治療后腫瘤生長明顯減少，腫瘤體積遠低于其他組(圖9B)。此外，各處理的體重在治療期間幾乎沒有變化。在結束時間點，M-FDH + X線治療組腫瘤體積僅為PBS對照組的16.25%，對腫瘤生長的抑制作用為83.75%。此外，M-FDH + X線治療腫瘤生長指數僅為1.94±0.38，遠低于其他治療(圖9C)。同時，M-FDH + X射線治療對腫瘤生長的有效抑制也通過評估各治療腫瘤腫塊的重量得到證實(圖9D)。

由于腫瘤基質是限制放射治療敏感性的關鍵因素，檢測了每種治療腫瘤中CAFs的頻率。與其他處理相比，M-FDH + X射線處理導致α-SMA^-、FAP^-和FSP^-表達的CAFs被全都消除(圖9E)。與PBS對照相比，M-FDH + X射線處理后α-SMA^-、FAP^-和FSP^-表達CAFs的比例分別減少84.49%、92.04%和93.20%(圖9G)。由于輻射可在腫瘤中誘導強烈的DNA損傷，評估了M-FDH + X射線治療對DNA損傷和DNA修復的影響，分別使用典型的標記γ-H2AX和PARP。在M-FDH + X射線處理組中，γ-H2AX表達明顯，但在其他組中很少可見，M-FDH + X射線處理的腫瘤中γ-H2AX信號分別比PBS對照和FDH + X射線處理的腫瘤增強了37.00和2.67倍(圖9F和H)。相比之下，未輻射組的腫瘤組織中很少檢測到典型的DNA修復標志物PPAP，但在PBS + X射線處理的腫瘤中明顯可見(圖9F)。然而，在M-FDH + X射線處理的腫瘤中，PARP表達僅為輻射的PBS組的6.61%和FDH + X射線處理的腫瘤的22.63%，表明DNA修復的有效減少(圖9F和H)。通過比較M-FDH + X與其他的治療組，在M-FDH + X治療組中PARP的下調可能是由于活性氧的增加和DNA損傷所致，這將有利于提高放射治療的療效。結果表明，M-FDH + X射線治療在消耗CAFs、誘導DNA損傷和減弱DNA修復方面表現出顯著的療效，這可能是其具有明顯的腫瘤抑制作用的重要原因。

隨后，在PANC02誘導的胰腺癌模型中評估了M-FDH + X線與aPD-L1的腫瘤抑制作用(圖10A)。當腫瘤大小達到約600mm³時，荷瘤小鼠被處死。兩劑治療后，M-FDH + X射線治療及其聯合aPD-L1治療明顯延緩腫瘤生長，而aPD-L1單藥治療對腫瘤生長幾乎沒有影響(圖10B和C)。此外，兩劑治療后，各組腫瘤小鼠的體重幾乎沒有變化(圖S24)。PBS死亡時，M-FDH + X線+ aPD-L1組的平均腫瘤體積分別為PBS、aPD-L1和M-FDH + X線組的15.91%、18.01%和52.75%。與其他治療相比，聯合治療顯著延長了生存時間(圖10D)。aPD-L1單藥治療在PANC02腫瘤模型中療效不佳可能是由于腫瘤的低免疫原性特征和免疫抑制的微環境。相比之下，M-FDH + X治療的治療方案能夠顯著誘導癌細胞的ICD，破壞腫瘤間質，改善殺傷腫瘤的CD3⁺CD8⁺ T細胞的浸潤，減少免疫抑制的M2巨噬細胞和Treg細胞，顯示出與aPD-L1協同有效治療癌癥的巨大潛力。這些數據驗證了M-FDH + X線+ aPD-L1治療在延緩腫瘤生長和延長生存期方面的有效性。

結論