產(chǎn)品貨號 ：CA1310
產(chǎn)品規(guī)格 ：100T
產(chǎn)品內(nèi)容 ：

保存條件 ：
    -20 ℃避光保存，盡量避免反復凍融，有效期一年。 超純水和 JC-10 染色緩沖液（5 ×）也可 4 ℃保存。

產(chǎn)品簡介 ：
    線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-10 ）是一種以 JC-10 為熒光探針，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細胞凋亡檢測。
    JC-10 是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位 Ψm  △ 的理想熒光探針。 可以檢測細胞、 組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-10 聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-10 不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時 JC-10 為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。
    線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過 JC-10 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用 JC-10 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。
    JC-10 單體的大激發(fā)波長為 515nm ，大發(fā)射波長為 529nm ；JC-10 聚合物的大激發(fā)波長為585nm ，大發(fā)射波長為 590nm 。實際觀察時，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設置即可。
    本試劑盒提供了 CCCP 作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照。對于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測 100 個樣品；對于 12 孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測 200 個樣品。
 

操作步驟 ：
1 、JC-10  染色工作液的配制 ：
    六孔板每孔所需 JC-10 染色工作液的量為 1mL ， 其他培養(yǎng)器皿的 JC-10 染色工作液的用量以此類推；對于細胞懸液每 50～100 萬細胞需 0.5mL JC-10 染色工作液。取適量 JC-10 （200×），按照每 50µL JC-10（200 ×）加入 8mL 超純水的比例稀釋 JC-10 。劇烈震蕩充分溶解并混勻 JC-10 。然后再加入 2mL JC-10染色緩沖液（5 ×），混勻后即為 JC-10 染色工作液。
2 、 陽性對照的設置 ：
    把試劑盒中提供的 CCCP（10mM ）推薦按照 1  1000  ∶ 的比例加入到細胞培養(yǎng)液中，稀釋 10µM ，處理細胞 20 分鐘。 隨后按照下述方法裝載 JC-10 ， 進行線粒體膜電位的檢測。 對于大多數(shù)細胞， 通常 10µMCCCP 處理 20 分鐘后線粒體的膜電位會*喪失， JC-10 染色后觀察應呈綠色熒光； 而正常的細胞經(jīng) JC-10染色后應顯示紅色熒光。對于特定的細胞，CCCP 的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關文獻資料決定。
3 、 對于懸浮細胞 ：
   （1）取 10～60 萬細胞，重懸于 0.5mL 細胞培養(yǎng)液中，細胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。
   （2）加入 0.5mL JC-10 染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細胞培養(yǎng)箱中 37 ℃孵育 20 分鐘。
   （3）在孵育期間，按照每 1mL JC-10 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-10 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。
   （4）37℃孵育結(jié)束后，600g 4 ℃離心 3～4 分鐘，沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。
   （5） 用 JC-10 染色緩沖液 （1×）洗滌 2 次： 加入 1mL JC-10 染色緩沖液 （1×） 重懸細胞， 600g 4 ℃離心 3～4 分鐘，沉淀細胞，棄上清。再加入 1mL JC-10 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600g 4 ℃離心 3～4 分鐘，沉淀細胞，棄上清。
   （6）再用適量 JC-10 染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀分析。
4 、 對于貼壁細胞 ：
   注意：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。
   （1）對于六孔板的一個孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實驗如有必要可以用 PBS 或其它適當溶液洗滌細胞一次，加入 1mL 細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
   （2）加入 1mL JC-10 染色工作液，充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20 分鐘。
   （3）在孵育期間，按照每 1mL JC-10 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-10 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。
   （4）37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用 JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌 2 次。
   （5）加入 2mL 細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
   （6）熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。
5 、 對于純化的線粒體 ：
   （1）把配制好的 JC-10 染色工作液再用 JC-10 染色緩沖液（1×）稀釋 5 倍。
   （2）0.9mL 5 倍稀釋的 JC-10 染色工作液中加入 0.1mL 總蛋白量為 10～100 µg 純化的線粒體。
   （3）用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描（time scan），激發(fā)波長為 485nm ，發(fā)射波長為 590nm 。如果使用熒光酶標儀，激發(fā)波長不能設置為 485nm 時，可以在475～520nm 范圍內(nèi)設置激發(fā)波長。另外，也可以參考下面步驟 6 中的波長設置進行熒光檢測。
   （4）用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟 6 。
6 、 熒光觀測和結(jié)果分析 ：
    檢測 JC-10 單體時可以把激發(fā)光設置為 490nm ，發(fā)射光設置為 530nm ；檢測 JC-10 聚合物時，可以把激發(fā)光設置為 525nm ，發(fā)射光設置為 590nm 。
    注意：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設置在大激發(fā)波長和大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測 JC-10 單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設置，如觀察 GFP 或 FITC 時的設置；檢測JC-10 聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或 Cy3 時的設置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細胞的狀態(tài)也比較正常。
 

注意事項 ：
   （1）JC-10 （200×）在 4 ℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以 20～25℃水浴溫育片刻全部融解后使用。
   （2） 必須先把 JC-10 （200×） 用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后， 才可以加入 JC-10 染色緩沖液 （5×） 。不可先配制 JC-10 染色緩沖液（1×）再加入 JC-10（200×），這樣 JC-10 會很難充分溶解，會嚴重影響后續(xù)的檢測。
   （3）裝載完 JC-10 后用 JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌時，使 JC-10 染色緩沖液（1×）保持 4 ℃左右，此時的洗滌效果較好。
   （4）JC-10 探針裝載完并洗滌后盡量在 30 分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。
   （5）請勿把 JC-10 染色緩沖液（5×）全部配制成 JC-10 染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用 JC-10 染色緩沖液（5×）。
   （6）如果發(fā)現(xiàn) JC-10 染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進溶解可以在 37℃加熱。
   （7）CCCP 為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護。
   （8）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

相關文獻： 

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